Moleculair klonen

Moleculair klonen is het maken van recombinant-DNA-moleculen voor de replicatie in gastheer-organismen met behulp van verschillende experimentele methoden uit de moleculaire biologie.[1]

De technologie
Schematische voorstelling van een klonering met openknippen door restrictie-enzymen en weer plakken met ligasen

Met genetische technologie kan een gen geïdentificeerd, geïsoleerd en gekloneerd worden. Gebruik makend van deze mogelijkheden worden met recombinant-DNA-technologie fragmenten DNA vermeerderd en opnieuw gecombineerd. Hierbij wordt een plasmiden opengeknipt met een restrictie-enzymen en de insertie geplakt met ligasen.[2] In de insertie mag geen restrictieplaats voorkomen voor het restrictie-enzym waarmee het plasmide is opengeknipt, omdat anders de insertie tegelijk met de plasmide stuk geknipt wordt. Bij de keuze van de plasmide moet hier dus rekening mee gehouden worden.

De isolatie van het gen

Het te isoleren gen kan komen van een prokaryoot, eukaryoot, een uitgestorven organisme of kunstmatig in het laboratorium worden gemaakt. Wanneer men een specifiek gen, de insertie, wil isoleren wordt eerst DNA uit de cellen van het organisme gehaald en het DNA gezuiverd. Met de polymerase-kettingreactie (PCR) wordt het gen vermeerderd. Omdat de PCR-techniek duurder is dan het gebruik van een vector wordt deze techniek meestal alleen voor een beperkte vermeerdering gebruikt. Het gen waarin men geïnteresseerd is kan geïdentificeerd worden op basis van de kennis die men vooraf van het gen heeft. Deze kennis kan men vaak halen uit cDNA- of gDNA-"bibliotheken".

Vectoren

Een vector dient als vermeerderaar van het DNA. Dit kan een stukje circulair bacterieel DNA oftewel plasmide zijn, maar ook een virus, een liposoom of een goudkogeltje waarop het DNA geplakt zit. Als vector wordt vaak de plasmide van de bacterie Escherichia coli gebruikt. Zo'n plasmide bevat een multiple cloning site (MCS), een plek die veel specifieke DNA-sequenties bevat waar restrictie-enzymen het DNA kunnen knippen. Op zo'n plek kan het vreemde DNA geplaatst worden, mits het met dezelfde restrictie-enzymen geknipt is. Ook is er in de plasmide een antibiotisch gen geplaatst, waardoor bacteriën met deze getransformeerde plasmide opgespoord kunnen worden op een medium met een antibioticum. Ook kunnen gisten als vector worden gebruikt.

Schoning

Eerst wordt het DNA afgezonderd van de cellulaire componenten zoals eiwitten, RNA en lipiden. Dit komt tot stand door het plaatsen van de gekozen cellen in een proefbuis met een oplossing die op mechanische en chemische wijze de cellen openbreekt. Deze oplossing bevat enzymen, chemicaliën en zouten die de cellen afbreken met uitzondering van het DNA. Het bevat enzymen die eiwitten oplossen, chemicaliën die alle RNA vernietigen, en zouten die het DNA uit de oplossing helpen.

Vervolgens wordt het DNA afgezonderd van de oplossing nadat het gescheiden wordt in een centrifuge zodat het DNA zich opstapelt op de bodem van de proefbuis. Na de centrifuge wordt de oplossing afgegoten en wordt het DNA in een tweede oplossing gebracht. Deze zorgt ervoor dat er met het DNA in de toekomst makkelijk te werken valt.

Het gevolg is een geconcentreerd monster DNA dat duizenden kopieën van elk gen bevat.

Toepassing

Moleculaire klonering kan worden gebruikt voor:

Zie ook
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.