Professor Hershel Layton

Layton's grootste vriend is Luke Triton, wat opvallend is aangezien Luke nog maar een kind is. Hij ontmoette Luke in Professor Layton en de Melodie van het Spook, waarin Luke Layton naar Misthallery haalt, terwijl hij zich voordoet als zijn vader Clark, de burgemeester en oude vriend van Layton. Layton en Luke hebben vrijwel direct een klik, en nadat dit mysterie opgelost is blijven Layton en Luke altijd contact houden. Zo beleven ze samen nog vijf avonturen.

Layton en Luke scheiden hun wegen wanneer Luke in Professor Layton en de Verloren Toekomst verhuist naar het buitenland. Layton ontvangt later wel nog een brief van Luke waarin Luke vraagt of Layton naar hem toe wil komen, maar het verhaal houdt hier op. De drie delen die werden uitgegeven na dit deel vormden een prequel-trilogie. Het is dus onbekend wat er gebeurd nadat Layton deze brief heeft ontvangen.

Andrew Schrader is Layton's oude mentor. Wanneer Layton afstudeert houden de twee echter wel contact en ze worden zelfs vrienden. Schrader komt voor het eerst in beeld in Professor Layton en de Doos van Pandora. Hier zou hij zijn overleden, hij blijkt echter niet dood maar "tijdelijk dood" te zijn geweest. In Professor Layton en de Verloren Toekomst komt Layton Schrader tegen in de "toekomst", het blijkt echter Don Paolo in vermomming te zijn geweest. Deze toekomst is namelijk eigenlijk een grot onder Londen.

Emmy Altava is Layton's assistente in Professor Layton en de Melodie van het Spook tot Professor Layton en de Erfenis van de Azran. Emmy wilde altijd al Layton's assistente worden, omdat Layton haar ooit op slimme wijze uit een benarde situatie heeft gehaald en Emmy kreeg hierdoor grote bewondering voor Layton.

Omdat Emmy niet voorkomt in de eerste trilogie, moest haar personage uit het verhaal geschreven worden aan het eind van de prequel-trilogie. Ze verraadt Layton en Luke en heeft daarna zo veel spijt dat ze vertrekt uit het leven van Layton, en ze belooft terug te zullen komen wanneer ze een waardige assistente kan zijn.

Flora Reinhold is de Golden Apple uit Professor Layton and the Curious Village, en in de twee opvolgende delen gaat ze vaak met Layton mee, voornamelijk omdat ze het zo goed met Luke kan vinden. Ze loopt vaak eerder in de weg dan dat ze iets handigs doet, maar Layton kan het goed met haar vinden en daarom maakt hij er geen groot probleem van.

Clark Triton is een vriend van Layton uit de studententijd, en de vader van Luke. Er is niet veel bekend over de vriendschap tussen Layton en Clark, alleen dat de twee elkaar uit het oog verloren toen ze allebei afgestudeerd waren. Desondanks moet Clark zijn zoon genoeg over Layton hebben verteld, dat Luke hem in vertrouwen neemt om hem naar Misthallery te halen.

Decaan Delmona is een decaan op de universiteit waar Layton regelmatig lezingen geeft over archeologie. Delmona vraagt Layton regelmatig om raad als zijn kleindochter een raadsel heeft bedacht waar hijzelf het antwoord niet op weet. Layton weet deze raadsels altijd te ontraadselen, en hoe vaak hij Delmona de oplossing ook uitlegt, hij is zelf nooit in staat de raadsel zelf op te lossen.

Layton heeft in het verleden een vriendin gehad, genaamd Claire Folley. Van haar heeft Layton zijn typische hoge hoed gekregen. Claire was wetenschapster, maar ze overleed in een experiment met een tijdmachine. De tijdmachine werkte echter enigszins, waardoor ze naar de toekomst werd geworpen, en een aantal dagen later weer terug naar het moment van de explosie waardoor ze in principe nooit echt zal sterven. In de toekomst komt ze Layton weer tegen. Eerst doet ze zich voor als Celeste, maar ze biecht later op Claire te zijn. Vlak daarna gaat ze echter weer terug naar de explosie.

Jean Descole is de grote vijand van Layton in de prequel-trilogie.

Descole moest worden weggewerkt aan het eind van de prequel-trilogie omdat hij in de originele trilogie niet voorkwam, en daarom bleek Descole in Professor Layton en de Erfenis van de Azran de broer van Layton te zijn. De twee maakten het goed, en hoopten elkaar ooit als broers te kunnen beschouwen.

Don Paolo is de grote vijand van Layton in de originele trilogie.

Don Paolo haat Layton vanwege Claire Folley. De twee waren allebei verliefd op Claire, maar Claire koos voor Layton en dit heeft Don Paolo hem nooit vergeven. Hij draaide door en valt Layton daarom nu vaak lastig. Ze kunnen echter samenwerken als het erop aankomt, blijkt in Professor Layton en de Verloren Toekomst.