Western blot

Een western blot is een biochemische techniek waarmee een specifiek eiwit in een mengsel van eiwitten door middel van antilichamen gedetecteerd kan worden. In het algemeen worden de eiwitten in het eiwitmengsel (bijvoorbeeld een cellysaat) eerst gescheiden op basis van hun grootte of beter gezegd, moleculair gewicht door middel van een SDS-PAGE-gel (gelelektroforese). Vervolgens worden de eiwitten die gescheiden zijn op grootte van de gel "overgebracht" naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan waar ze vervolgens aan hechten. Dit proces wordt blotten genoemd. De Western Blot wordt gebruikt in biochemisch en medisch onderzoek en in diagnostiek. De Western Blot behoort tot de groep van de immunoblots.

Een elektroforeseopstelling. Door de gel loopt een stroom waardoor de negatief geladen eiwitten naar beneden migreren.

Geschiedenis

De naam van het vlekkenproces ("Western Blot") komt van de Engelse woord voor vlek en van het Engelse woord voor vloeipapier, dat een identieke indruk van het origineel geeft. Western blotting is ontwikkeld als een naamspel, gebaseerd op de zogenaamde Southern blot, een soortgelijke methode voor het opsporen van specifieke DNA-sequenties. Edwin Southern wordt beschouwd als de uitvinder van de vlekkentechniek. In 1975 ontwikkelde hij een methode voor de scheiding van DNA-fragmenten en de daaropvolgende hybridisatie, Southern blot genaamd. De overeenkomstige scheiding van RNA-fragmenten werd Northern blot genoemd naar zijn naam.[1] Daarom werd het eiwitvlekken met SDS Western Blot genoemd. De Far-Western blot is ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties te onderzoeken. Als combinatie van de Western en de Southern blot werd de Southwestern blot ontwikkeld voor de detectie van DNA-eiwit interacties, net als de Northwestern blot voor de detectie van RNA-eiwit interacties.

Werking

Elektroforetische scheiding van eiwitten

In de eerste stap wordt het eiwitmengsel door middel van gelelektroforese in afzonderlijke eiwitbanden gescheiden in een dragermatrix (SDS-PAGE, Native-PAGE, isoëlektrische focussering, 2D-gelelektroforese), afhankelijk van de grootte van het eiwit, de lading of andere eigenschappen.[2]

Het overbrengen van eiwitten naar een membraan

De afgescheiden eiwitbanden worden vervolgens overgebracht van de gel naar een vast draagmembraan (nitrocellulose, nylon of PVDF) voor de Western blot. Dit proces wordt blotting maken genoemd. Daar worden ze geblokkeerd met melk (of andere blokkerende middelen) om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen, en vervolgens gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor het doeleiwit.[3]

Detectie van eiwitten na het blotten

Indirect via antilichamen

Het eiwit waarin men geïnteresseerd is kan gedetecteerd worden met een voor dat eiwit specifiek antilichaam. Om dit specifiek gebonden antilichaam zichtbaar te maken wordt na incubatie met dit eerste antilichaam de blot behandeld met een tweede antilichaam dat bindt aan het eerste antilichaam. Dit tweede antilichaam is gelabeld zodat men precies kan zien waar het eerste antilichaam gebonden heeft en het eiwit zich dus bevindt.

Western blot waarbij liponzuur gemodificeerde eiwitten zichtbaar zijn gemaakt met een rood fluorescerend tweede antilichaam

Direct met kleurstoffen of autoradiografie

Na blotten kan de membraan ook gekleurd worden met specifieke kleurstoffen zoals Ponceau-S om alle overgebrachte eiwitten zichtbaar te maken.

Nitrocellulosemembraan gekleurd met Ponceau-S. De blauwe banden aan de linkerkant zijn markereiwitten voor bepaling van het moleculair gewicht

Indien de eiwitten zelf gelabeld zijn, bijvoorbeeld met radioactief zwavel, kunnen ze na blotten zichtbaar worden gemaakt met een autoradiogram.

Western blot waarbij radioactief gelabelde eiwitten zichtbaar zijn gemaakt met autoradiografie


Zie de categorie Polyacrylamide gel electrophoresis van Wikimedia Commons voor mediabestanden over dit onderwerp.

Zie ook

References
  1. Alwine J, Kemp D, Stark G (1977) . Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74 (12): 5350–5354 . PMID: 414220. PMC: 431715. DOI: 10.1073/pnas.74.12.5350.
  2. https://www.antibodies-online.com/resources/17/1224/western-blotting-immunoblot-gel-electrophoresis-for-proteins/
  3. Burnette WN (1981) . 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry 112 (2): 195–203 . ISSN:0003-2697. PMID: 6266278. DOI: 10.1016/0003-2697(81)90281-5.
    This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.